Ремонт 

Что такое метод днк. Способ обработки и анализа изображений кометоподобных объектов, полученных методом "днк-комет"

1

Проведено изучение показателей фрагментации ДНК методом ДНК-комет в щелочной модификации в условиях разного уровня воздействия радиационного фактора в бытовых условиях. Проведен учет объемной активности (ОА) радона, мощности амбиентной эквивалентной дозы (МАЭД) гамма-излучения и плотности потока бета-излучения. Среднее значение ОА радона в воздухе помещений составило 89,4 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,12 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,6 с-1. Средний уровень фрагментации ДНК составил 3,48%. Уровень фрагментации ДНК по 3 показателям (доля ДНК в хвосте кометы, длина хвоста кометы, момент хвоста кометы) был повышен у мужчин, но данная тенденция не достигала статистической значимости. Показатели ДНК-комет не отличались значимо в зависимости от изменения уровня радона. Была обнаружена положительная корреляция показателей ДНК-комет с увеличением мощности гамма-излучения. При этом МАЭД гамма-излучения находилась в пределах допустимых норм во всех обследованных помещениях.

ионизирующее излучение

днк-кометы

щелочная модификация днк-комет

эффекты низких доз облучения

1. Robertson A., Allen J., Laney R., Curnow A. The cellular and molecular carcinogenic effects of radon exposure: a review // Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 7, pp. 14024-14063.

2. Druzhinin V.G., Sinitsky M.Y., Larionov A.V. et al. Assessing the level of chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes in long-term resident children under conditions of high exposure to radon and its decay products // Mutagenesis, 2015, vol. 30, pp. 677–683.

3. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Res., 1988, vol. 175, pp. 184–191.

4. Azqueta A., Gutzkow K.B., Brunborg G., Collins A.R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions // Mutat. Res., 2011, vol. 724, no. 1–2, pp. 41-45.

5. Konca K., Lankoff A., Banasik A. et al. A cross platform public domain PC image analysis program for the comet assay // Mutation Research, 2003, vol. 534, pp. 15-20.

6. Glantz S.A. Primer of Biostatistics / S.A. Glantz. – McGraw-Hill Medical, 7 edition, 2011. – 320 p.

7. Georgakilas A.G., O’Neill P., Stewart R.D. Induction and repair of clustered DNA lesions: what do we know so far? // Radiat. Res., 2013, vol. 180, pp. 100–109.

8. Kaur S., Sangeeta, Galhna K.K., Gautam N. Assessment of radiation induced DNA damage in human peripheral blood lymphocytes using COMET assay // Int. J. Life Sci. Scientifi. Res., 2017, vol. 3, no. 4, pp. 1208-1214.

9. Miklos M., Gajski G., Garaj-Vrhovac V. Usage of the standard and modified comet assay in assessment of DNA damage in human lymphocytes after exposure to ionizing radiation // Radiology and Oncology, 2009, vol. 43, no. 2, pp. 97-107.

10. Batar B., Guven M., Baris S. et al. DNA repair gene XPD and XRCC1 polymorphisms and the risk of childhood acute lymphoblastic leukemia // Leuk. Res., 2009, vol. 33. pp. 759–763.

11. Jiang J., Zhang X., Yang H., Wang W. Polymorphisms of DNA repair genes: ADPRT, XRCC1, and XPD and cancer risk in genetic epidemiology // Meth. Mol. Biol., 2009, vol. 471. pp. 305–333.

12. Larionov A.V., Sinitsky M.Yu., Druzhinin V.G. et al. DNA excision repair and double-strand break repair gene polymorphisms and the level of chromosome aberration in children with long-term exposure to radon // Int. J. Radiat. Biol., 2016, vol. 92, no. 8, pp. 466-474.

13. Wojewodzka M., Kruszewski M., Iwanenko T. et al. Lack of adverse effect of smoking habit on DNA strand breakage and base damage, as revealed by the alkaline comet assay // Mutat. Res., 1999, vol. 440, pp. 19–25.

14. Geric M., Gajski G., Orescanin V., Garaj-Vrhovac V. Seasonal variations as predictive factors of the comet assay parameters: a retrospective study // Mutagenesis, 2017, doi:10.1093/mutage/gex023.

Воздействие радона хорошо изучено в диапазоне высоких концентраций. Установленные гигиенические нормативы предусматривают уровень эквивалентной равновесной объемной активности (ЭРОА) в 200 Бк/м3 как границу допустимой объемной активности радона в воздухе жилых помещений. В то же время в ряде стран допустимый уровень увеличен до 400 Бк/м3, что объясняется, прежде всего, геологическими особенностями территории. С другой стороны, существует точка зрения о необходимости снижения допустимого уровня до 2 пКю/л, что соответствует 74 Бк/м3. В рамках современной парадигмы ВОЗ и принципа линейного беспорогового увеличения радиационных эффектов даже небольшое радиационное воздействие приводит к увеличению риска возникновения стохастических эффектов (прежде всего онкозаболеваний).

Очевидно, что небольшие радиационные эффекты, воздействующие на большие группы людей, могут приводить к социально значимому увеличению частоты онкологической заболеваемости . Вследствие этого представляется крайне актуальным накопление информации об эффектах действия различных типов ионизирующего излучения в малых дозах, которому подвержено в той или иной степени все население планеты. Увеличение ЭРОА радона выше 200 Бк/м3 признается нежелательным для большинства принятых нормативов в области радиационной гигиены. В то же время лишь 5-10% жилых помещений можно отнести к помещениям с таким уровнем воздействия. Уровень объемной активности (ОА) радона в 2 пКю/л (74 Бк/м3) и выше может отмечаться в 20-50% жилых помещений в зависимости от типа застройки и географического расположения. Очевидно, что даже малоинтенсивное воздействие радона может приводить к значимому увеличению заболеваемости, учитывая глобальные масштабы проблемы. Представляется актуальным исследование влияния низкодозовых нагрузок плотноионизирующего излучения на организм человека.

Радон признается в настоящее время одним из наиболее опасных канцерогенов, действующих на человека. В природе радиационный радоновый фактор не играет существенной роли, поскольку газ радон рассеивается в большом объеме воздуха и достаточно быстро распадается (период полураспад Rn222=3,82 суток). В то же время жилые и технические постройки представляют собой своеобразные ловушки, накапливающие радон (до 10 крат в сравнении с открытым воздухом). Очаги выделения радона часто располагаются спорадически, радон рассматривается в качестве ведущей причины повышения частоты хромосомных аберраций в схожих экспонированных группах .

Одним из эффективных методов биомониторинга является прямая оценка степени повреждения ДНК в клетках крови методом «ДНК-комет» (гель-электрофорез отдельных клеток). Данный метод предусматривает лизис клеток, помещенных в агарозный гель, при этом ДНК мигрирует в электрическом поле. Клетки с увеличенной частотой двойных разрывов характеризуются увеличением миграции ДНК к аноду. В 1988 году в работе Singh и коллег была предложена щелочная модификация метода, включающая этап лизиса при рН>13 . Данная версия значительно повышает чувствительность метода, позволяя выявлять одиночные разрывы, щелочелабильные сайты, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, а также сайты незавершенной репарации . Поскольку для большинства генотоксикантов преобладают эффекты одиночных разрывов ДНК, щелочная модификация метода позволила существенно увеличить информативность и чувствительность теста. Одно из главных преимуществ - возможность выявить генотоксическое воздействие в условиях одновременного действия цитотоксических факторов, которые приводят к формированию хромосомных нарушений, но не обладают генотоксическим действием. В условиях рН>12 ДНК денатурирует, и нити расплетаются вследствие разрушения водородных связей между 2 спиралями. При достижении рН 12,6 щелочелабильные сайты, например апуриновые/апиримидиновые сайты, трансформируются в одиночные разрывы ДНК. При рН>13 достигается максимальная степень трансформации щелочелабильных сайтов.

Материалы и методы

Характеристика выборки

Каждый обследованный заполнял персональную анкету, включавшую информацию о возрасте, состоянии здоровья, употреблении табака и алкоголя, производственных вредностях, рентгенодиагностических процедурах, авиаперелетах, прививках и приемах лекарственных препаратов в течение 3 месяцев, предшествующих обследованию. Была отобрана группа из 39 обследованных, не подвергавшихся потенциально генотоксическим факторам. Все обследованные были не старше 40 лет. Всего было обследовано 18 мужчин (средний возраст 29 лет) и 21 женщина (средний возраст 31 год).

Исследование проводили в соответствии с требованиями Комиссии по этике Кемеровского государственного университета, протокол исследования утвержден на заседании Комиссии № 4 от 10.10.2016 г. Каждый участник подписывал форму информированного согласия, содержащую информацию о целях исследования.

Образцы биоматериала

Образцы венозной крови собирались в вакуумные пробирки емкостью 4 мл, содержащие натрий-ЭДТА в качестве антикоагулянта. Сбор материала происходил в период с ноября 2016 г. по апрель 2017 г. В течение 1-2 часов образцы переправлялись лабораторию. Все образцы кодировались и обрабатывались. Выполнение метода «ДНК-комет» начиналось немедленно после поступления образцов.

Гель-электрофорез отдельных клеток (метод «ДНК-комет»)

Метод «ДНК-комет» выполнялся в щелочной модификации, разработанной Singh с коллегами . Первый слой геля представлял собой 1% раствор стандартной агарозы (Applichem, США). Для нанесения клеток использовали 1% агарозу с низкой температурой плавления (low melting point agarose, Applichem, США) при 39 °С. 70 мкл взвеси клеток крови в легкоплавкой агарозе вносили на стекло со стандартной агарозой и помещали на лед до полного застывания геля. После застывания стекла помещали в лизирующий буфер при температуре 4 °С на 12 часов. Состав лизирующего буфера: 2,5 моль/л NaCl («Вектон», Россия), 0,1 моль/л Nа2ЭДТА («Вектон», Россия), 1% Тriton Х-100 (Amresco, США), 10% ДМSO («Вектон», Россия). После лизиса проводился горизонтальный электрофорез (300 мА, 25 В, 30 мин.) в щелочном буфере (pH>13). Электрофорезу предшествовала 20-мин. обработка щелочным буфером (300 мМ NaOH («Вектон», Россия), 1 мМ Nа2ЭДТА («Вектон», Россия). Лизис и электрофорез проводился при 4 °С при отсутствии прямых солнечных лучей. После электрофореза стекла троекратно нейтрализовали в фосфатно-солевом буфере PBS рН 7,5 (Amresco, США). После этого стекла обрабатывались 70% этанолом в течение 5 минут. Препараты высушивались и окрашивались 50 мкл однократного SYBR GREEN («Биотех-Индустрия», Россия).

Анализ «комет»

Оценка параметров фрагментации проводилась путем микрофотографирования препаратов, окрашенных SYBR GREEN, с помощью микроскопа Zeiss Axio Imager 2. Всего фотографировалось 100 случайно отобранных комет от каждого исследованного образца при увеличении х400. Последующая обработка фотографий проведена с помощью комплекта ПО CASP . Рассчитывались параметры длины хвоста кометы, момента хвоста, а также доля ДНК в хвосте кометы.

Статистические методы

Статистический анализ данных проводили с использованием пакета Statistica 10.0. Для количественных показателей рассчитывались средние значения и пределы 95% доверительного интервала (CI 95). Сравнение групп выполняли с использованием U-теста Манна-Уитни. Степень значимости была принята на уровне 5%. Корреляцию между показателями для случая непараметрических данных рассчитывали с использованием коэффициента корреляции Пирсона для рангов. При этом для выборок более 50 человек также рассчитывали значение критерия Стьюдента, основанное на значении коэффициента корреляции Пирсона .

Результаты

Доля ДНК в хвосте кометы не превышала 15%. Среднее значение объемной активности (ОА) радона в воздухе помещений составило 89,4 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,12 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,6 с-1. Уровень фрагментации ДНК по 3 показателям был повышен у мужчин, но данная тенденция не достигала статистической значимости (табл. 1).

Таблица 1

Показатели фрагментации ДНК у обследованных мужчин и женщин

В качестве граничного уровня ОА радона в воздухе был выбран уровень 74 Бк/м3, соответствующий 2 пКю/л воздуха. Средняя ОА радона составила 47 Бк/м3 в первой группе и 143 Бк/м3 во второй группе. Наибольшая информативность была установлена для показателя момента хвоста комет. Момент хвоста был повышен в группе с более высоким уровнем радона, но эта тенденция не достигла уровня статистической достоверности (табл. 2). Данная тенденция характерна только для обследованных мужчин.

Таблица 2

Показатели фрагментации ДНК в группах, дифференцированных по полу и ОА радона

ОА радона в воздухе помещений, Бк/м3

% ДНК в хвосте кометы

Длина хвоста, мкм

Момент хвоста кометы

3,65

13,73

0,94

3,97

14,52

1,43

3,30

13,21

0,88

3,00

11,95

0,72

3,43

13,42

0,90

3,51

13,30

1,09

Также была исследована возможная зависимость показателей ДНК от величины МАЭД гамма-излучения в жилых помещениях. Для проверки был рассчитан коэффициент корреляции между показателями повреждений ДНК и МАЭД гамма-излучения. Была обнаружена положительная корреляция показателей ДНК-комет с увеличением мощности гамма-излучения (рисунок). При этом МАЭД гамма-излучения находилась в пределах допустимых норм во всех обследованных помещениях.

Зависимость показателей фрагментации ДНК от МАЭД гамма-излучения в жилых помещениях (r - коэффициент корреляции Спирмена, p - вероятность «нулевой» гипотезы)

Обсуждение

Радиационное воздействие

Ионизирующее излучение способно индуцировать образование кластеров повреждения ДНК, что реализуется в форме двухцепочечных разрывов и другими повреждениями, расположенными компактно. Редко- и плотноионизирующее излучение вызывает примерно одинаковое количество отдельных ДНК-поражений на единицу поглощенной дозы, но в случае с плотноионизирующим излучением (альфа-частицы) эти поражения распределены в меньшем количестве участков ДНК, что подразумевает увеличение числа повреждений в кластере; например, среднее число повреждений по кластеру, как правило, увеличивается с увеличением линейной передачи энергии . Гамма-излучение, зафиксированное в местах проживания всех обследованных, не превышает регламентированных фоновых значений. Изменения гамма-фона, скорее всего, были вызваны особенностями строений и строительными материалами.

Анализ «комет»

Метод «ДНК-комет» представляет простой и быстрый тест, позволяющий эффективно измерять уровень повреждений ДНК и репарации повреждений, следующей после экспонирования. В данном исследовании не было обнаружено значительной гетерогенности в отношении уровня повреждения ДНК в исследованной популяции. В ряде работ, посвященных биологической дозиметрии, ранее отмечались трудности выявления эффекта малых доз облучения . В то же время в большинстве работ исследовались группы лиц, облученных внешним искусственным источником, например персонал радиологических и рентгенологических установок.

Измерения показателей фрагментации ДНК могут отражать как индивидуальный уровень повреждений ДНК, так и способность к репарации радиационных повреждений. Ранее в ряде работ установлена способность генов репарации модулировать частоту нарушений наследственного материала . Наблюдаемая картина повреждений ДНК является результатом равновесия между нарушениями и репарацией ДНК, и низкий уровень повреждений или отсутствие выраженных корреляций может быть результатом как низкого числа повреждений, так и высокой индивидуальной эффективности репарации .

По некоторым оценкам, наибольший вклад в увеличение показателей ДНК комет для непроизводственных факторов вносят сезон года (параметры увеличены летом) и медицинское облучение . В нашей работе эти факторы не могут оказывать значимого влияния, поскольку сбор биологического материала проводился в зимний период года, а все лица, проходившие рентгеновские обследования в течение 3 месяцев, предшествующих исследованию, были исключены из выборки. Отсутствие корреляций с объемной концентрацией радона, возможно, объясняется небольшим размером выборки. В дальнейшем планируется продолжение данной линии исследования с увеличением размера выборки.

Заключение

Исследование эффектов длительного воздействия малых доз облучения представляется сложной задачей, необходимость подбора выборок и контроля сопутствующих факторов способна исказить картину. В представленном исследовании не удалось выявить статистически значимых корреляций с показателями объемной активности радона, но в то же время обнаруженные корреляции с показателями гамма-фона указывают на перспективы данного исследования. Очевидна необходимость оценки фактора эффективности репарации обследованных для исследования такого типа, это позволило бы провести дифференцировку и сравнить людей с близкими характеристиками репарации.

Конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (№ 16-34-60069\15 мол_а_дк).

Библиографическая ссылка

Ларионов А.В., Волобаев В.П., Сердюкова Е.С. ИЗУЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДНК-КОМЕТ У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНЫХ РАДИАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ ЖИЛЫХ ПОМЕЩЕНИЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27215 (дата обращения: 01.02.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Вы знаете, что изучением комет занимаются не только астрономы, но и молекулярные биологи? Их работа связана с космосом лишь косвенно. На кометы они смотрят в микроскоп. Звездным небом служит гель-слайд - микроскопическое предметное стекло, покрытое агарозой с исследуемыми клетками. Такое стало возможным благодаря открытию в 1984 году способа анализа ДНК, названного методом ДНК-комет.

О популярности в цифрах

Рисунок 2. Примеры повреждений ДНК, возникающих в результате действия факторов разной природы

Как видите, «разбойники» могут совершить огромный спектр «преступлений» и нанести существенный урон целостности ДНК. Однако в клетке на страже безопасности ДНК стоят системы репарации , «лекари», которые исправляют повреждения молекулы с помощью специальных «медикаментов» - ферментов, способных «залатать раны», нанесенные генотоксикантами. Ферментов репарации великое множество. На сегодняшний момент известно, что в эксцизионной репарации повреждений ДНК, т.е. в операциях, когда участок сначала вырезается, а потом собирается вновь, принимает участие 13 ферментов !

Однако не все так гладко, как кажется на первый взгляд. Операции в «отделении репарации» не всегда завершаются благополучно, т.е. восстановлением исходной молекулы ДНК. Итогом работы восстановительных систем могут стать и новые повреждения. Причина тому - весьма плотная упаковка нитей ДНК в ядре .

А что же ученые? Они выступают в роли «полицейских», которым нужно выявить «состав преступления», т.е. найти «преступника» и его «сообщников» (определить генотоксиканты, их дозы и концентрации) и установить тяжесть «преступления» (выявить степени повреждений ДНК). Именно в таких ситуациях помогает метод ДНК-комет.

Родом из Швеции

Попытки, направленные на изучение ядерных структур клетки и количественное определение нитевых повреждений ДНК в одиночных клетках организмов, были предприняты еще в 80-х гг. XX века такими учеными, как Кук и Бразелл , Ридберг и Йохансон . Однако лишь в 1984 г. шведские исследователи Остлинг и Йохансон развили новый метод определения повреждений ДНК . Именно они заметили, что изображения фрагментов ДНК, мигрировавших в электрическом поле, напоминали астрономические кометы. Сходство было налицо. «Кометы», полученные учеными из Швеции, обладали главными характеристиками космических «собратьев»: они имели «голову» и «хвост» . Отсюда и пошло такое романтическое название - метод ДНК-комет.

У метода есть еще ряд наименований - гель-электрофорез одиночных (изолированных) клеток и электрофорез в микрогеле . Первое название некорректно отражает суть анализа. Электрофорез проводится не в одиночных клетках, а в агарозном геле, где от одного полюса к другому движется ДНК, выделенная из этих самых клеток. Второе - верное, т.к. электрофорез осуществляется в агарозном геле, нанесенном на слайды. Но и этот термин не прижился. Указанные названия не пользуются большой популярностью и используются редко, в отличие от «метода ДНК-комет».

Заклинание для получения «комет»

Рисунок 3. Строение «кометы».

Лабораторные «кометы» - объекты интересные. Их облик напрямую зависит от факторов воздействия, их силы и условий проведения анализа. Информация о «кометах» не тайна, покрытая мраком, поэтому про их состав, строение и образование известно практически все.

В публикации 1984 г. шведы Остлинг и Йохансон назвали ДНК, которая мигрировала, - «хвост», а оставшуюся в полости ДНК - «центр» . Сейчас же практически ничего не изменилось: у «кометы» условно выделяют «голову» и «хвост» (рис. 3).

Надо четко представлять, что «комета» образуется не из клетки живого организма, а именно из ее ДНК. Помещенная в агарозный слой суспензия клеток образует полости, которые в процессе лизиса занимает ДНК этих клеток. Все дальнейшие манипуляции в методе ДНК-комет осуществляются именно с ДНК.

«Кометы» образуются в процессе миграции (перемещения) ДНК в электрическом поле (когда есть ток и напряжение). Что же происходит во время лизиса и электрофореза ? Более маленькие биомолекулы, входящие в состав клетки, «убегают» в лизирующий раствор в процессе диффузии, в отличие от ДНК, которая из-за своего чрезвычайно большого размера не может сдвинуться с места . Когда же слайды с ДНК подвергают электрофорезу, неповрежденная ДНК формирует «голову кометы», а поврежденные части молекул начинают «пробежки» по направлению к положительно заряженному источнику тока - аноду (т.к. ДНК заряжена отрицательно), образуя «хвост». Чтобы увидеть получившиеся «кометы», их окрашивают флуоресцентными красителями (бромистый этидий, акридиновый оранжевый и др.), а затем визуализируют с помощью флуоресцентного микроскопа на большом увеличении (рис. 4).

Остлинг и Йохансон пишут следующее: «Когда клетка встраивается в гель, она формирует углубление в нем. После лизиса клетки ее ДНК занимает это углубление. Большинство других биомолекул легко диффундирует по агарозному гелю. Таким образом, практически все они выходят из углубления, оставленного клеткой, в лизирующий раствор. Единственное исключение составляет ДНК, которая за счет своей большой молекулярной массы остается в геле» . - Ред.

Рисунок 4. Последовательность этапов метода ДНК-комет (начиная сверху по часовой стрелке). * - Этап необходим только в щелочной версии метода (рН > 13,0), чтобы нейтрализовать щелочь NaOH.

Чем сильнее повреждения ДНК (а степень повреждения зависит от дозы мутагена), тем более выражен «хвост кометы». Как вы уже поняли, длинный «хвост» - это не очень хорошо.

Универсальный солдат

Метод ДНК-комет - инструмент широкого профиля. С его помощью ученые «раскрывают преступления», связанные с покушением на здоровье человека и безопасность окружающей среды (конечно же, все это через исследование поврежденной ДНК). Метод приобрел такую популярность благодаря привлекательным характеристикам - простоте, скорости, экономичности и достаточно высокой чувствительности, которая позволяет выявлять повреждения ДНК, вызванные даже факторами низкой интенсивности (например, малыми дозами радиации). Среди множества способов оценки повреждений ДНК метод ДНК-комет является одним из самых подходящих в этой области. Помимо указанных выше преимуществ, он выигрывает, например, у широко известных цитогенетических методов (ана-телофазный , метафазный анализы , микроядерный тест ), еще и по другим веским причинам .

Метод ДНК-комет позволяет работать с любыми содержащими ДНК клетками, в отличие от микроядерного теста, в котором чаще всего задействуют клетки крови или костного мозга. Если же ана-телофазный и метафазный методы ограничены в перечне определяемых хромосомных аберраций , то метод ДНК-комет предоставляет широкий спектр своих модификаций, благодаря которым исследователь может выявить самые разные повреждения ДНК: одиночные, двойные повреждения, щелочно-лабильные сайты, апоптоз и другие. Именно такие возможности делают его «универсальным солдатом» и прокладывают методу дороги в разные области научных исследований , :

  • экологический мониторинг - оценка состояния окружающей среды по степени повреждения ДНК организмов, обитающих на исследуемой территории (как правило, сравнивают уровни повреждения ДНК особей с загрязненной и контрольной территорий);
  • биологический мониторинг - изучение влияния питания и других внешних факторов среды на организм по степени повреждения ДНК, накоплению повреждений и репарации;
  • генотоксические исследования фармакологических препаратов, новых и уже имеющихся химических веществ (бытовая химия, пестициды и др.);
  • клинические исследования , направленные на дородовую диагностику на стадии внутриутробного развития, выявление предрасположенности к заболеваниям;
  • оценка эффективности терапий при онкологических заболеваниях и ее контроль.

Изменения познаются в сравнении

Наблюдение за состоянием окружающей среды, т.н. экологический мониторинг , помогает исследователям выявлять происходящие в среде изменения и вовремя бить тревогу (особенно в аварийных ситуациях, например, на Чернобыльской АЭС в 1986 г. или на АЭС «Фукусима Дайичи» в 2011 г.). При загрязнениях среды метод ДНК-комет в сочетании с организмами-индикаторами приходится как нельзя кстати. Списки организмов, характерных для разных сред обитания и наиболее чувствительных к изменениям состояния среды, достаточно обширны и включают виды, начиная с бактерий Escherichia coli и водорослей рода Chlamydomonas и заканчивая высшими растениями (Lemna minor, Pinus sylvestris ), млекопитающими (Microtus oeconomus ) и, конечно же, человеком (рис. 5). В методе ДНК-комет задействуют, как правило, не организмы целиком, а их «составные части» - клетки, особенно чувствительные к изменениям факторов внешней среды, или ткани, из которых эти клетки можно получить. У животных обычно берут клетки крови: эритроциты и лимфоциты, гемоциты (аналоги эритроцитов у беспозвоночных), целомоциты (клетки, выполняющие иммунную функцию у дождевых червей); у растений - клетки меристемы, интенсивно делящейся ткани.

Примечание: В анализе повреждений ДНК можно использовать и целых особей, если они представлены одной клеткой, как, например, Chlorella vulgaris .

Рисунок 5. Примеры организмов-индикаторов, используемых для оценки состояния окружающей среды с помощью метода ДНК-комет.

сайты scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net, nhm.ac.uk, picstopin.com, functionalecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com, hdimagelib.com

Как метод ДНК-комет работает в данном случае? Ученые сравнивают степени повреждения ДНК организмов-индикаторов, обитающих на исследуемой (загрязненной) и контрольной (незагрязненной) территориях: подвергаемых воздействию загрязненной почвы, воды и др., и таких же, но живущих в обычных контрольных условиях, т.е. когда отсутствует воздействие изучаемого фактора либо оно незначительно. Оценку степени повреждения ДНК проводят и в лабораториях, в строго контролируемых условиях, когда есть выборка организмов, подвергнутая воздействию исследуемого фактора или группы факторов (радиации, металлов, пестицидов), и обязательно контрольная группа (не испытывающая этого воздействия).

Пример: 11 марта 2011 г. в результате сильнейшего в Японии землетрясения и последовавшего за ним цунами произошла серьезная радиационная авария на АЭС «Фукусима Дайичи». В 2014 г. японские ученые провели исследование. Они выбрали два участка, пострадавших в результате аварии: с высоким уровнем радиации (2,85 мкЗв/ч) и с низким (0,28 мкЗв/ч) в качестве контроля. У дождевых червей семейства Megascolecidae с этих участков проанализировали степень повреждения ДНК. Оказалось, что этот показатель достоверно выше у особей, подвергнутых воздействию высокого уровня радиации, чем у особей на участке с низким уровнем воздействия .

Сценарии могут быть разными. Степень повреждения ДНК в клетках может повышаться, снижаться или же оставаться неизменной. Повышенная степень повреждения ДНК у организмов с загрязненной территории может свидетельствовать о внутренних изменениях в функционировании клеток, которые приводят к многочисленным «поломкам» ДНК.

Примеры: Некоторые металлы, поступая в организм, индуцируют активные формы кислорода (АФК), вызывающие повреждения ДНК ; ионизирующее излучение способствует образованию свободных радикалов, также являющихся «обидчиками» ДНК. Действие ультрафиолетовых лучей может приводить к образованию димеров в ДНК , нарушающих связь двух ее цепочек и таким образом меняющих конформацию молекулы.

Снижение степени повреждения ДНК или отсутствие различий наталкивает на мысль, что организмы справились с «гнетом» генотоксикантов и приспособились к жизни в этих неблагоприятных условиях. Такое приспособление носит название адаптации. Но это совсем другая история.

Наследственность - страшная сила

Слышали о таких заболеваниях, как синдром хромосомных поломок (синдром неймегеновского повреждения), пигментная ксеродерма и трихотиодистрофия ? Они проявляются только тогда, когда оба родителя - носители дефектного гена (рис. 6).

В литературе есть данные о возможности применения метода ДНК-комет в диагностике этих наследственных заболеваний, что особенно важно на пренатальной стадии, т.е. при беременности.

Синдром неймегенского повреждения (Nijmegen breakage syndrome, NBS ) - заболевание, связанное с постоянными нарушениями целостности ДНК. Проблема заключается в том, что в гене NBS1 происходит мутация, которая «выключает» нибрин - белок, контролирующий восстановление парных разрывов ДНК, индуцируемых радиацией. Именно поэтому люди, страдающие этим синдромом, являются чрезвычайно радиочувствительными . Божена Новотна из пражского Института экспериментальной медицины в своем исследовании утверждает, что метод ДНК-комет отлично помогает выявить гетерозиготных носителей гена NBS1 по аномально высокому уровню повреждений нитей ДНК в «кометах» лимфоцитов .

Не менее опасными являются пигментная ксеродерма и трихотиодистрофия . Это серьезные заболевания человека, передающиеся по наследству. В первом случае при непродолжительном нахождении на солнце у детей на открытых участках кожи (кистях рук, шее, лице) сначала появляются красные пятна, которые впоследствии переходят в выраженную пигментацию вплоть до образования опухолей. Второе заболевание выражается в ломкости волос и ногтей, задержке в умственном развитии и аномалиях в строении черепа.

Эти заболевания объединяет нарушение в работе эксцизионной репарации нуклеотидов. По успешности эксцизионной репарации нуклеотидов в клетках плода с помощью метода ДНК-комет можно выявить, будет ли ребенок страдать этими заболеваниями. В литературе описаны случаи такой диагностики .

Перед исследователями стояла задача: до рождения выяснить, будут ли дети болеть пигментной ксеродермой и трихотиодистрофией. Эксперименты проводились в семьях, в которых родители являются носителями генов пигментной ксеродермы (семья Х ) и трихотиодистрофии (семья Y ) и уже имеют детей с этими заболеваниями .

Семья Х : беременность 15 недель, мать - носитель гена пигментной ксеродермы, есть ребенок 3-х лет с этим заболеванием.

Семья Y : беременность 10 недель, отец и мать - носители гена трихотиодистрофии, двое детей с трихотиодистрофией умерли в возрасте 22 месяца и 6 лет, еще один - в результате спонтанного аборта (выкидыша).

Все клетки в течение 45 минут подвергали действию ультрафиолетового излучения.

Исследование семьи Х : Уровень повреждений ДНК в клетках плода, определенный с помощью метода ДНК-комет, был близок к уровню повреждений ДНК в фибробластах матери-носительницы, т.е. соответствовал уровню нитевых повреждений в условиях нормальной работы эксцизионной репарации ДНК. Вывод - плод здоров. Этот вывод подтвердился после рождения нормального ребенка.

Исследование семьи Y: в клетках плода по сравнению с фибробластами отца и матери выявлен дефект в работе эксцизионной репарации, который был подтвержден и другим методом, не основанном на изучении репарации. Выявлено, что плод болен. После разговора с семьей было решено делать аборт.

Промышленность - враг здоровья человека

Здоровье людей, работающих на промышленных объектах или проживающих в экологически неблагоприятных районах, каждый день подвергается риску. Опасность заключается не только в ежедневном тесном контакте организма с генотоксикантами (ионизирующим излучением, тяжелыми металлами и другими химикатами), но и в вероятности аварийных ситуаций (примеры см. выше), последствия которых могут быть катастрофичны для организмов. Изменения состояния организма могут быть самыми разными, начиная с легких недомоганий вроде головной боли и заканчивая раковыми заболеваниями.

Метод ДНК-комет можно применять в качестве перспективного инструмента первичной оценки состояния генома людей, работающих или проживающих в экологически неблагоприятных условиях. Это означает, что ДНК-кометы можно использовать не только в перечисленных сферах исследований, но и применять в будущем в других областях, расширять варианты применения метода в клинических исследованиях, медицине и многом другом.

Примеры: В Польше в результате аварии на заводе по изготовлению батареек работники подверглись сильному воздействию свинца и кадмия, которое привело к незначительному, но достоверному повышению уровня повреждений ДНК по сравнению с группой людей, не испытавших такого стресса . Генотоксическое действие газосварочных аэрозолей, содержащих тяжелые металлы - марганец, хром, никель, кадмий, кобальт, свинец, молибден, железо, - на ДНК лейкоцитов выявлено для людей, чья работа в течение долгого времени связана со сваркой .

Есть и некоторые трудности

Чтобы правильно использовать метод ДНК-комет, нужно «знать в лицо» не только его возможности и достоинства перед другими методами, но и, конечно же, недостатки, ограничения и трудности, с которыми нужно быть начеку. Метод требует оптимизации лизиса, электрофореза и других условий в зависимости от типа клеток, которые использует ученый, и целей исследования.

Пояснение: клетки растений и животных требуют разных условий для высвобождения ДНК, т.е. лизиса. Из-за наличия целлюлозной клеточной стенки на лизис растительных клеток тратится больше времени, чем у животных.

Из первой трудности вытекает второе неудобство: адаптация метода к задачам анализа может быть очень трудоемким процессом (хотя сама методика проста и понятна), особенно если с объектом вашего исследования никто не работал по методу ДНК-комет. Бывает, «настройка» методики в таком случае требует очень много времени.

Иногда возникают сложности в интерпретации результатов, полученных по степени повреждения ДНК, поскольку степень повреждения не всегда удается соотнести с дозой фактора воздействия.

Пояснение: Такая проблема может быть связана с недостаточной оптимизацией метода, когда к одним типам повреждений примешиваются другие и искажают тем самым результаты. Вносить «смуту» в реальную степень повреждения ДНК могут и системы репарации, которые исправляют какую-то часть возникающих нарушений.

Одной из самых главных трудностей можно назвать сопоставление результатов , полученных с помощью метода ДНК-комет разными учеными в разных лабораториях и научно-исследовательских институтах. Для оценки повреждения ДНК используют методики с модификациями и абсолютно разные показатели (например, процент ДНК в «хвосте кометы» или длину «хвоста»).

Пояснение: Длина «хвоста кометы» - расстояние, на которое мигрировала ДНК от «головы» хвоста. Процент ДНК в «хвосте кометы» - это количество ДНК, мигрировавшей в «хвост», выраженное в процентах. С полным списком показателей оценки повреждения ДНК можно ознакомиться на сайте www.cometassayindia.org .

Активно предпринимаются попытки стандартизировать применение метода ДНК-комет, что поможет сравнивать полученные учеными результаты. Например, в генотоксических исследованиях разработаны протоколы и методические рекомендации .

Пояснение: В методических рекомендациях Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора четко определены тест-объекты (клетки человека) и подробно описаны все этапы анализа. Согласно данным рекомендациям, с помощью метода ДНК-комет проверять на генотоксичность можно товары бытовой химии и изделия из полимерных материалов.

Заключение

«Кто вооружен, тот защищен» - таков девиз работы с методом ДНК-комет. Знание достоинств и трудностей применения данного способа оценки повреждения ДНК позволяет мастерски манипулировать ходом работы, избегать «подводных камней» и получать корректные результаты.

Метод ДНК-комет играет роль «палочки-выручалочки» в оценке общего состояния организма, как правило, на ранних этапах воздействия неблагоприятных факторов среды. На начальном этапе именно повреждения ДНК являются самым быстрым и поэтому единственно доступным для измерения ответом организма на неблагоприятное воздействие еще задолго до появления изменений на физиологическом уровне.

Теперь вы знаете, как биологи получают «кометы» в лабораториях и зачем они им так нужны.

Литература

  1. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). The comet assay: A sensitive method for detecting DNA damage in individual cells . Methods . 48 , 46–53;
  2. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции: учебник для студентов высших учебных заведений (3-е издание, перераб. и доп.). СПб.: Н-Л, 2015. - 720 с.;
  3. Piperakis S.M. (2009). Comet assay: a brief history . Cell Biol. Toxicol. 25 , 1–3;
  4. Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. М.: Высш. шк., 2004. - 549 с.;
  5. Cook P.R. and Brazell I.A. (1976). Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA . J. Cell Sci. 22 , 303–324;
  6. Rydberg B. and Johanson K.J. Estimation of single strand breaks in single mammalian cells . In: DNA repair mechanisms / ed. by Hanawalt P.C, Friedberg E.C, Fox C.F. NY: Academic, 1978. P. 465–468;
  7. Ostling O. and Johanson K.J. (1984). Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells . Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 , 291–298;
  8. Cotelle S. and Ferard J.F. (1999). Comet assay in genetic ecotoxicology: a review . Environ. Mol. Mutagen. 34 , 246–255;
  9. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. et al. (2000). Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing . Environ. Mol. Mutagen. 35 , 206–221;
  10. Филиппов Э.В. (2014). Использование метода «ДНК-комет» для детекции и оценки степени повреждений ДНК клеток организмов растений, животных и человека, вызванных факторами окружающей среды (обзор) . Наука и образование . 2 , 72–78;
  11. Collins A.R. (2004). The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations . Mol. Biotechnol. 26 , 249–261;
  12. Fujita Y., Yoshihara Y., Sato I., Sato S. (2014). Environmental radioactivity damages the DNA of earthworms of Fukushima Prefecture, Japan . Eur. J. Wildl. Res. 60 , 145–148;
  13. Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005). Does uranium exposure induce genotoxicity in the teleostean Danio rerio ? First experimental results . Radioprotection . 40 , 175–181;
  14. Каган М.Ю., Шулакова Н.С., Тумирова Р.А., Злодеева Е.А., Резник Н.В. (2012). Синдром Ниймеген (клиническое наблюдение) . Педиатрическая фармакология . 3 , 102–105;
  15. Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). The comet assay as a repair test for prenatal diagnosis of Xeroderma pigmentosum and trichothiodystrophy . J. Invest. Dermatol. 108 , 154–159;
  16. Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003). Genotoxic effects of occupational exposure to lead and cadmium . Mutat. Res. 540 , 19–28;
  17. Томилин Н.В., Петров А.Н., Филько О.А., Храброва А.В., Соловьева Н.Е., Иванова Т.М. и др. (2015). Оценка степени повреждения ядерной ДНК в клетках периферической крови людей, профессионально связанных с действием тяжелых металлов . Организация здравоохранения . 16 , 383–392;
  18. Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro : Методические рекомендации . М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.- 16 с.

Способ заключается в том, что в компьютер с биологического препарата, установленного на флуоресцентный микроскоп с видеокамерой, вводят изображение с кометоподобными объектами - «кометами», представляющими собой набор слитых и отдельностоящих флуоресцирующих точек разной яркости. Затем выполняют поиск этих «комет» на изображении, выделяют их контур с определением границы «головы» и «хвоста» и проводят микроскопическую морфометрию. Перед поиском «комет» на изображении выполняют оптимизацию уровней яркости изображения и низкочастотную фильтрацию с целью объединения отдельных точек «комет» в размытые области. Затем выполняют сегментацию полученного изображения на основе порога яркости, определяемого как смещение от фона, нахождение контуров «комет» методом заполнения ограниченной области «с затравкой», где под затравкой понимается произвольная точка, принадлежащая «комете», нахождение центра головы каждой «кометы», путем определения центра тяжести точек с интенсивностью свечения, близкой к максимальной. Определение виртуальной границы «головы» и «хвоста» проводят путем зеркального отражения распределения интенсивностей свечения точек передней части головы кометы, затем проводят микроскопическую морфометрию «комет», путем измерения: длины «кометы», «хвоста», диаметра «головы». Затем вычисляют процентное содержание ДНК во всей «комете», в «хвосте» и меры поврежденности ДНК. Перечисленные операции осуществляют автоматически, одновременно над всеми «кометами» на серии изображений. Технический результат заключается в повышении точности и скорости обработки и анализа изображений «комет».

Способ обработки и анализа изображений кометоподобных объектов, полученных методом «ДНК-комет» (comet assay или single cell gel electrophoresis - SCGE), в биологических препаратах, относится к области обработки и анализа изображений объектов - «комет», и предназначен для компьютеризации (автоматизации) процессов морфометрических исследований в области биомедицины, проводимых для определения степени повреждений молекул ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды, для изучения репарации молекул ДНК на уровне одиночных клеток, для оценки интегральной целостности генома, для определения индивидуальной радиочувствительности онкологических больных, проходящих курс лучевой терапии, для биоиндикации прибрежных морских вод, иными словами для мониторинга широкого спектра повреждений ДНК, вызванных мутагенными факторами окружающей среды.

Изображения «комет» представляют собой набор слитых и отдельностоящих флуоресцирующих точек разной яркости, полученных методом гельэлектрофореза лизированных единичных клеток (метод «ДНК-комет»), поэтому обрабатывать и анализировать их способами, предназначенными для изображений обычных (сплошных) объектов, нет возможности.

В настоящее время изображения «ДНК-комет» анализируют либо путем визуального наблюдения под флуоресцентным микроскопом и дифференциации их по степени поврежденности ДНК, либо с использованием компьютерных средств обработки изображений.

При визуальном анализе (Struwe М, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photo comet assay - A fast screening assay for the determination of photogenotoxicity in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 632 (1-2), p.44-57) «ДНК-кометы» ранжируют на пять условных типов с соответствующим числовым значением от 0 до 4. Степень поврежденности ДНК при этом выражается как индекс «ДНК-комет» (И днк), определяемый по формуле

И днк =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

где n 0 -n 4 - число «ДНК-комет» каждого типа, - сумма подсчитанных «ДНК-комет».

Данный способ обработки и анализа очень трудоемок, субъективен, имеет только пять уровней градации дифференциации «ДНК-комет» и поэтому имеет невысокую точность, а отсюда и низкую достоверность результатов.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ компьютерного анализа изображений «ДНК-комет», реализованный в программном обеспечении SCGE-Pro (см. Chaubery R.С. Computerized Image analysis software for the comet assay. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106), принятый за прототип. Данный способ анализа «комет» менее трудоемок и особенно необходим для объективной оценки их параметров (например, длины «кометы», длины «хвоста», диаметра «головы», процентного содержания ДНК в «голове» или в «хвосте» и т.д.), которые используются в качестве показателей, характеризующих уровень повреждений ДНК в изучаемых клетках. Способ позволяет находить «кометы» на изображении и вычислять их параметры как в ручном, так и в автоматическом режиме.

Недостатком известного способа является способ определения границ «кометы» с помощью прямоугольной области, который снижает точность вычисления параметров, необходимых для оценки повреждений (особенно, если повреждения слабо выражены) ДНК, так как в этом случае к комете могут быть отнесены и помехи, находящиеся рядом. Кроме того, при данном способе анализа граница «головы» и «хвоста» определяется как прямая, перпендикулярная оси «кометы» и разделяющая комету на «голову» и «хвост», что сильно снижает точность вычисления длины «хвоста кометы» и процентного содержания ДНК в «голове» и в «хвосте».

Техническим результатом изобретения является повышение точности и скорости обработки и анализа изображений «комет», полученных методом «ДНК-комет», включая фильтрацию, сегментацию «комет», выделение их контура с определением границы «головы» и «хвоста», что позволяет повысить достоверность результатов при микроскопической морфометрии, необходимой для компьютеризации процессов биометрических исследований, проводимых при мониторинге широкого спектра повреждений ДНК, вызванных различными мутагенными факторами окружающей среды.

Технический результат достигается тем, что способ обработки и анализа изображений кометоподобных объектов, полученных методом «ДНК-комет», заключающий в том, что в компьютер с биологического препарата, установленного на флуоресцентный микроскоп с видеокамерой, вводят изображение с кометоподобными объектами - «кометами», представляющими собой набор слитых и отдельностоящих флуоресцирующих точек разной яркости, выполняют поиск этих «комет» на изображении, выделяют их контур с определением границы «головы» и «хвоста», проводят микроскопическую морфометрию, при этом перед поиском «комет» на изображении выполняют оптимизацию уровней яркости изображения и низкочастотную фильтрацию с целью объединения отдельных точек «комет» в размытые области, затем выполняют сегментацию полученного изображения на основе порога яркости, определяемого как смещение от фона, нахождение контуров «комет» методом заполнения ограниченной области «с затравкой», нахождение центра «головы» каждой «кометы», путем определения центра тяжести точек с интенсивностью свечения, близкой к максимальной, определение виртуальной границы «головы» и «хвоста», путем зеркального отражения распределения интенсивностей свечения точек передней части «головы кометы», затем проводят микроскопическую морфометрию «комет», путем измерения: длины «кометы», «хвоста», диаметра «головы» и вычисления процентного содержания ДНК во всей «комете», «в хвосте», меры поврежденности ДНК и многие другие параметры, характеризующие степень поврежденности ДНК в зависимости от решаемой задачи, причем перечисленные операции осуществляются автоматически, одновременно над всеми «кометам» на изображении или серии изображений.

Способ осуществляется путем выполнения последовательности следующих процедур:

1. Ввод в компьютер с биологического препарата, установленного на флуоресцентный микроскоп с видеокамерой, изображения с кометоподобными объектами - «кометами», представляющими собой набор слитых и отдельностоящих флуоресцирующих точек разной яркости.

2. Оптимизация уровней яркости изображения. Нулевая яркость - фон, максимальная яркость - центр головы «кометы».

3. Низкочастотная фильтрация по Гауссу (размытие) с большим радиусом, равным 1/10 радиуса средней «кометы», выполняется с целью объединения отдельных точек «комет» в размытые области. Для предотвращения слияния «комет», расположенных близко друг к другу, в интерактивном режиме используется корректировка радиуса размытия.

4. Сегментация полученных размытых областей выполняется на основе порога яркости. Порог определяется автоматически как смещение от фона (в изображении нет посторонних включений и других объектов кроме «комет»), но возможна коррекция порога в интерактивном режиме.

5. Нахождение контуров «комет» методом заполнения ограниченной области «с затравкой», где под затравкой понимается произвольная точка, принадлежащая «комете».

Нахождение центра «головы кометы». Для определения могут использоваться два метода: по максимуму распределения интенсивности свечения точек «кометы» вдоль горизонтальной оси или по центру тяжести точек с интенсивностью свечения, превышающей 80% от максимума.

Определение виртуальной границы «головы» и «хвоста», путем зеркального отражения распределения интенсивностей свечения точек передней части «головы кометы» (передняя часть - это часть до передней границы головы «кометы»).

Выполнение микроскопической морфометрии «комет», путем измерения: длины «кометы», длины «хвоста», диаметра «головы» и вычисления процентного содержания ДНК во всей «комете», «в хвосте», меры поврежденности ДНК и многие другие параметры, характеризующие степень поврежденности ДНК в зависимости от решаемой задачи.

9. Вывод значений полученных параметров каждой кометы выполняется в таблицу MS EXCEL для реализации постановки задачи пользователя, например для дальнейшего статистического анализа либо классификации «комет» по степени повреждения структуры ДНК.

Таким образом, в предлагаемом способе каждая область кометы определяется их сложным контуром, что повышает точность вычисления параметров, в отличие от известного способа, где границы «комет» определяются с помощью прямоугольной области, которая снижает точность вычисления параметров, необходимых для оценки повреждений (особенно, если повреждения слабо выражены) «ДНК-комет», так как в этом случае к «комете» могут быть отнесены и помехи, находящиеся рядом. Кроме того, в известном способе граница «головы» и «хвоста» определяется как прямая, перпендикулярная оси кометы и разделяющая комету на «голову» и «хвост». В предлагаемом способе применяется виртуальная граница, определяемая путем вычисления центра «головы кометы» и зеркального отражения распределения интенсивности свечения точек передней части «головы кометы». Это существенно повышает точность вычисления длины хвоста кометы и процентного содержания ДНК в «голове и в хвосте».

Следует отметить, что все перечисленные операции выполняются автоматически одновременно над всеми «кометами» на изображении или серии изображений.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ обработки и анализа изображений кометоподобных объектов, полученных методом «ДНК-комет», заключающийся в том, что в компьютер с биологического препарата, установленного на флуоресцентный микроскоп с видеокамерой, вводят изображение с кометоподобными объектами - «кометами», представляющими собой набор слитых и отдельностоящих флуоресцирующих точек разной яркости, выполняют поиск этих «комет» на изображении, выделяют их контур с определением границы «головы» и «хвоста», проводят микроскопическую морфометрию, отличающийся тем, что перед поиском «комет» на изображении выполняют оптимизацию уровней яркости изображения и низкочастотную фильтрацию с целью объединения отдельных точек «комет» в размытые области, затем выполняют сегментацию полученного изображения на основе порога яркости, определяемого как смещение от фона, нахождение контуров «комет» методом заполнения ограниченной области «с затравкой», где под затравкой понимается произвольная точка, принадлежащая «комете», нахождение центра головы каждой «кометы» путем определения центра тяжести точек с интенсивностью свечения, близкой к максимальной, определение виртуальной границы «головы» и «хвоста» путем зеркального отражения распределения интенсивностей свечения точек передней части головы кометы, затем проводят микроскопическую морфометрию «комет» путем измерения длины «кометы», «хвоста», диаметра «головы» и вычисления процентного содержания ДНК во всей «комете», в «хвосте» и меры поврежденности ДНК, причем перечисленные операции осуществляют автоматически, одновременно над всеми «кометами» на серии изображений.